一、样本室表面洁净
上样的样本室要擦拭干净，或细胞计数板要保持表面洁净。任何污染都可能导致不准确的结果。对于手动细胞计数，这涉及到移除和清洁盖玻片，并用70%的乙醇和水清洗计数室。当使用一次性塑料载玻片时，每个样品需要一个新的载玻片(如果载玻片有两个腔室，则需要一对样品)。
二、样本制备
如何制备目的细胞对手动和自动细胞计数的影响极大。应保持样本均匀性，方能确定计数差异是由实验处理还是样本制备条件引起的。
下面是样本制备的一些小技巧，可以提高您的计数准确度和精度。
- 标准化细胞操作步骤
- 确保细胞悬液混合均匀。
利用短暂且温和的涡旋振荡方法或手动搅拌试管——有时被称为“手指轻弹”技巧——可以制备均匀的悬液。将细胞置于实验台上放置一会然后移液，会导致细胞沉至管底，形成人为的浓度梯度，存在出错的可能性。细胞样本静置时间越长，浓度梯度越大，从而提高了差异性。为使移液差异最小化，应按照上述方法混合样本，然后从试管中间而不是试管底部 (底部可能形成人为的高浓度细胞)移液。
- 尽可能减少碎片。
不论选择何种计数或染色方法，含有大量碎片的样本都难以进行计数和存活率评估。碎片的数量因细胞类型、培养条件、制备方案和使用的试剂不同而异。考虑碎片可能的形成原因并采用措施尽可能地减少碎片，可以提升细细胞计数需要对整个原液的一个小样本进行分析，因此必须小心确保该样本是原始原液培养的代表。胞计数和存活率结果的准确性。
- 最大程度地减少细胞样本碎片的常见技巧：
- 在使用前离心台盼蓝
- 使用新鲜配制的染色试剂 (台盼蓝、NucBlue™ Live、碘化丙啶等)
- 使用经过过滤除菌的培养基和缓冲液
- 根据需要的时间间隔传代细胞
- 减少细胞结团
细胞计数需要对整个原液的一个小样本进行分析，因此必须小心确保该样本是原始原液培养的代表。虽然自动细胞计数仪能够应用算法来识别块内的细胞，但它们无法纠正非代表性样本。当手动计数时，团块的评分比单个细胞更具主观性，增加了用户与用户之间的可变性。细胞裂解后的细胞外DNA和细胞碎片是凝块形成的常见原因。细胞裂解可能是由于过度生长、通过过多的管道输送或冻融循环进行的机械剪切，以及胰蛋白酶消化不足或过度等因素造成的，这些因素也可能导致样本的不均匀。通过避免细胞裂解的原因和过滤细胞碎片样品，可以减少细胞团块。
三、正确调整聚焦
无论是手动计数还是依靠软件算法，重要的是要调整焦距和曝光设置，以确保单元格的最佳可见性，从而获得最精确的结果。最佳聚焦和曝光将显示细胞膜和背景之间的强烈对比。
A. 聚焦：在最佳聚焦下，活细胞的膜将在明亮的白色中心周围形成一个黑色的环；
B. 曝光：调整曝光，使强度最大，而不允许信号超出细胞边界。在调整过程中，可在亮场和荧光通道之间切换。在明场视野下，荧光信号的直径不应大于细胞边界。使用双荧光通道时，每个通道的曝光应单独设置。
四、适当调整参数与阈值
- 光强度
无论是台盼蓝或是荧光染色，都都必须使背景 (如噪声) 最小化同时使信号最大化，这样可以提高灵敏度并最大程度地提高信噪比。实现上述目标的要求之一是通过调整光源正确设置光强度。
- 细胞圆度、大小、亮度等
大多数自动细胞计数仪都包括可调整的参数设置，以最佳匹配研究中的细胞。例如，可以设置和保存细胞大小范围，以便从分析中排除碎片或其他细胞种群。也可以使用设置来定义细胞形状，可以在细胞计数之前或之后调整设置，并根据新的参数重新分析数据。
圆度：在大多数情况下，碎片的形状不规则，采用台酚蓝染色呈暗色，在许多自动细胞计数仪 (包括Countess II自动细胞计数仪) 中使用圆度参数可以将其高效“排除”。
大小：根据大小进行明场设门通常应用于有多种细胞类型的应用 (如神经和干细胞培养、血液样本或有碎片存在时)。使用自动细胞计数仪，用户可以轻松设门，在计数中包括或排除特定的细胞 (图6)。采用Countess II自动细胞计数仪，必须注意，用户可以针对活细胞和死细胞群体单独设门，从而提高了灵活性。
亮度：根据荧光强度设门提高了设门策略的灵活性。在许多情况下，用户只想知道多少细胞的信号模糊以及明亮，或者表达荧光蛋白。图7A显示了表达GFP的样本，包含两种细胞群体——信号模糊以及明亮；信号模糊的细胞被排除，13%的计数细胞表达较强的GFP。在图7B中，存在两种荧光颜色，可通过结果界面的“更多”(More) 按钮，根据大小、亮度、圆度和荧光强度单独设门。Countess II FL可以保存上述参数，以确保样本间的一致性，供以后使用。
五、总结
造成细胞计数结果差异的原因有很多种。样本制备、焦距设置、光强度设置和设门策略都会对结果产生影响。遵循这些提示将有助于提高细胞计数的准确性和再现性。
参考资料
1] 实现精准细胞计数的四个关键要素. Life
2] 191-Seven-Tips-to-Improve-Cell-Counting-Accuracy. Denovix
养细胞要用好血清！
微信扫一扫打赏
用户评论
■孤独像过不去的桥≈
这篇文章简直太棒了！之前每次做细胞计数都感觉好累赘，结果也不准。看了这篇帖子才知道原来一些小技巧可以让计数更快更精准，我现在是不是可以尝试一下啊？！
有7位网友表示赞同！
灼痛
提高细胞计数的准确度确实很重要，特别是做科研的时候。 我还发现了其他的一些方法，比如使用更好的显微镜视野、更合理的放大倍数等等。文章里提到的几点都是非常实用的经验，感谢作者分享！
有17位网友表示赞同！
该用户已上天
我也有同样的困扰，每次计数都觉得浪费时间精力啊，尤其是那些细胞数量比较少的时候。 这篇帖子里的方法很有启发性，我想试试看能不能提高我的工作效率！
有10位网友表示赞同！
素颜倾城
我觉得这个标题有点夸张了，提高细胞计数的准确度本来就很重要，不需要什么特别的“tips”。还是老老实实按照标准步骤操作最重要.
有7位网友表示赞同！
tina
文中提到的那些技巧其实并不新鲜，很多人都知道。文章里写的像是在说新的发现一样，感觉有点夸大其词
有6位网友表示赞同！
厌归人
我觉得作者说的很有道理，有时候细小的细节确实会影响细胞计数的准确度！ 尤其要注意观察视野中细胞的状态和数量分布，有些时候需要调整倍数来确保每一个细胞都能被清晰地看到 。
有12位网友表示赞同！
虚伪了的真心
做细胞计数的时候真的需要注意很多细节啊，比如要保证血清样本的温度、实验环境的通风等等。 这些影响都很大，文章里提到的技巧也让我有了新的启发！
有6位网友表示赞同！
哽咽
做了很久细胞计数的工作，说实话，感觉这种小技巧并不能改变基本的操作步骤，对效率提升作用有限...
有12位网友表示赞同！
日久见人心
其实我一直都觉得最关键的是熟练度和经验积累，再多的技巧也比不过长期实践的积累。文章里的内容对于新手可能比较有用吧。
有15位网友表示赞同！
纯真ブ已不复存在
我感觉文章说的有点过于简单化了。细胞计数是一个复杂的过程，需要综合考虑很多因素，不能光凭一些小技巧就提高准确性！
有20位网友表示赞同！
古巷青灯
做科研的时候，精确的细胞计数的确很重要啊！ 这篇帖子分享了一些实用的技巧，对我的实验操作很有帮助！
有17位网友表示赞同！
娇眉恨
这篇文章很有用！我一直在学习如何提高细胞计数的准确度，这篇博文的经验分享会给我很多指导！
有16位网友表示赞同！
浅笑√倾城
我刚开始做细胞计数，遇到很多的困难，文章里的技巧非常及时！ 我现在可以尝试这些方法来提升我的操作能力了。
有20位网友表示赞同！
南宫沐风
感谢作者分享这些实用的经验！ 之前我做了很久的实验，却一直找不到合适的计数方法，现在看到了这篇文章，终于找到了解决办法！
有11位网友表示赞同！
蹂躏少女
做细胞计数的时候真的需要注意很多细节啊，比如要保证环境干净、操作规范等等。 文章里提到的技巧也让我觉得很有启发。
有6位网友表示赞同！
全网暗恋者
我感觉文章里提到的这些小技巧并不是最重要的， 准确的细胞计数还要靠扎实的理论知识和丰富的实验经验，不能仅仅依靠一些技巧就可以解决问题！
有18位网友表示赞同！
怪咖
作者写的不错，把很多细节都考虑到了，非常实用！ 我会把这篇文章保存起来，以后可以参考一下。
有7位网友表示赞同！