问题的提出:看了全国的高考生物试题,分子生物学的比例都有所增加,接下来陆续选择一些经典试题解析,一方面接下来的高三一轮复习准备;另一方面,也了解一下高考命题的思路。
2024年高考生物新课标二卷压轴题打破了名地常规的基因工程试题,即用双酶切法进行拼接DNA片段完成转基因技术,而是用基因编辑技术——PCR和CRISPR/Cas9技术进行“基因敲除”和拼接,试题包含了基因结构、PCR和CRISPR/Cas9技术等知识,特别是使用 CRISPR/Cas9 修改基因组,切割后如何修复?个人认为,限于高中生物学教材,试题的难度相当大,原因在于对试题的理解上即读题上带来困难,如M1和M2片段是有什么作用?
试题:某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(I~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5\'→3\'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是。
参考答案:磷酸二酯键 保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性,确保N基因能在菌株B2中表达
解析:限制酶切割的化学键是磷酸二酯键。由题意可知,该过程是将含N基因的重组质粒插入M1、M2,再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1+启动子+N基因+终止子+M2),再插入B1基因组中,得到B2,因此,M1和M2之间需要保证N基因的完整性,同时,需要保证N基因能够正常表达,因此,需要把M1接入启动子之前,M2接入终止子之后。
第二空的答案,也有的观点是,分别保证启动子、N基因和终止子的完整性,还有干脆没有写启动子和终止子,即保证N基因的完整性,确保N基因能够顺利表达,那么问题来了,启动子和终止子是不是属于目的基因的?
人教版选择性必修3教材中,基因是主要编码蛋白质的基因,言外之意就是基因还有不编码蛋白质的部分,那就是调控序列,我的理解主要就是指启动子和终止子。浙科版教材上有基因的如下结构图,从图中的文字的叙述中可知,基因结构应该包含启动子和终止子。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和。
参考答案:U-A A-T C-G
解析:根据题意,向导RNA需要与对应的DNA结合,RNA的碱基会与DNA的碱基互补配对,根据碱基互补配对原则,配对的方式有G-C、C-G、U-A、A-T。
试题的配对答案很简单,但是要理解试题的全貌需要了解CRISPR/Cas9技术,特别是剪接后如何修复?为什么试题中提到了M1和M2?
CRISPR/Cas9技术作为一种基因编辑手段,具有巨大潜力,可以精准地编辑生物基因组。其原理基于细菌的天然免疫系统,通过指导蛋白(Cas)和RNA的配合来精确修饰DNA序列。RISPR/Cas系统通过切割基因、插入新基因,能够快速、精确地修改目标生物的遗传信息。
sgRNA具有与所选基因组目标序列互补的区域(图中黄蓝色区);该区域可设计为包括任何所需序列。由CRISPR(原核生物基因组内的一段重复序列,是细菌抵御病毒入侵的一种防御手段)、sgRNA和Cas9蛋白组成的复合物在细胞内形成,并与DNA中选定的靶位点结合。Cas9蛋白中的两个核酸酶活性位点分别切割靶序列中的两条链(一个核酸酶活性位点作用于一条链),产生双链断裂。
切割后,有几种可能性。其一,生物体自身存DNA损伤修复的应答机制,会将断裂上下游两端的序列连接起来,从而实现了细胞中目标基因的敲除;其二,如果给细胞提供同源修复模板,模板就会被插入到切口里。而该试题是后者,利用同源区段M1和M2修复(注意:不是用高中常规试题双酶切来拼接)。
由于CRISPR/Cas9系统的应用也越来越广泛,能在DNA 序列的任意位置进行切割,故适用于遗传信息的精准编辑——引入小小的基因突变、插入新基因、关闭某个基因的功能(即不给细胞提供同源修复模板)。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是。
参考答案:细菌B2的基因组DNA 无PCR扩增产物
解析:根据题意,用引物P1和P2需要验证是否插入重组后的片段甲,所有的模板应该为菌株B2的基因组进行PCR,如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因,如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。
因为片段甲被替换,因此在重组片段甲(M1+启动子+N基因+终止子+M2)中,没有引物P4的结合位置,因此,使用引物P3和P4进行PCR时无法获得PCR产物。
(4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是(答出2点即可)。
参考答案:无环境污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,高效利用秸秆资源等
解析:秸秆焚烧会引起环境污染,并且有很大的火灾隐患,与此同时,焚烧对于秸秆有机物的能量是一种浪费。