问题的提出：看了全国的高考生物试题，分子生物学的比例都有所增加，接下来陆续选择一些经典试题解析，一方面接下来的高三一轮复习准备；另一方面，也了解一下高考命题的思路。

2024年高考生物新课标二卷压轴题打破了名地常规的基因工程试题，即用双酶切法进行拼接DNA片段完成转基因技术，而是用基因编辑技术——PCR和CRISPR/Cas9技术进行“基因敲除”和拼接，试题包含了基因结构、PCR和CRISPR/Cas9技术等知识，特别是使用 CRISPR/Cas9 修改基因组，切割后如何修复？个人认为，限于高中生物学教材，试题的难度相当大，原因在于对试题的理解上即读题上带来困难，如M1和M2片段是有什么作用？

试题：某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。

（1）限制酶切割的化学键是。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是。

参考答案：磷酸二酯键 保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能在菌株B2中表达

解析：限制酶切割的化学键是磷酸二酯键。由题意可知，该过程是将含N基因的重组质粒插入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替换区（M1+启动子+N基因+终止子+M2），再插入B1基因组中，得到B2，因此，M1和M2之间需要保证N基因的完整性，同时，需要保证N基因能够正常表达，因此，需要把M1接入启动子之前，M2接入终止子之后。

第二空的答案，也有的观点是，分别保证启动子、N基因和终止子的完整性，还有干脆没有写启动子和终止子，即保证N基因的完整性，确保N基因能够顺利表达，那么问题来了，启动子和终止子是不是属于目的基因的？

人教版选择性必修3教材中，基因是主要编码蛋白质的基因，言外之意就是基因还有不编码蛋白质的部分，那就是调控序列，我的理解主要就是指启动子和终止子。浙科版教材上有基因的如下结构图，从图中的文字的叙述中可知，基因结构应该包含启动子和终止子。

（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和。

参考答案：U－A A－T C－G

解析：根据题意，向导RNA需要与对应的DNA结合，RNA的碱基会与DNA的碱基互补配对，根据碱基互补配对原则，配对的方式有G－C、C-G、U-A、A-T。

试题的配对答案很简单，但是要理解试题的全貌需要了解CRISPR/Cas9技术，特别是剪接后如何修复？为什么试题中提到了M1和M2？

CRISPR/Cas9技术作为一种基因编辑手段，具有巨大潜力，可以精准地编辑生物基因组。其原理基于细菌的天然免疫系统，通过指导蛋白(Cas)和RNA的配合来精确修饰DNA序列。RISPR/Cas系统通过切割基因、插入新基因，能够快速、精确地修改目标生物的遗传信息。

sgRNA具有与所选基因组目标序列互补的区域（图中黄蓝色区）；该区域可设计为包括任何所需序列。由CRISPR（原核生物基因组内的一段重复序列，是细菌抵御病毒入侵的一种防御手段）、sgRNA和Cas9蛋白组成的复合物在细胞内形成，并与DNA中选定的靶位点结合。Cas9蛋白中的两个核酸酶活性位点分别切割靶序列中的两条链（一个核酸酶活性位点作用于一条链），产生双链断裂。

切割后，有几种可能性。其一，生物体自身存DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除；其二，如果给细胞提供同源修复模板，模板就会被插入到切口里。而该试题是后者，利用同源区段M1和M2修复（注意：不是用高中常规试题双酶切来拼接）。

由于CRISPR/Cas9系统的应用也越来越广泛，能在DNA 序列的任意位置进行切割，故适用于遗传信息的精准编辑——引入小小的基因突变、插入新基因、关闭某个基因的功能（即不给细胞提供同源修复模板）。

（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是。

参考答案：细菌B2的基因组DNA 无PCR扩增产物

解析：根据题意，用引物P1和P2需要验证是否插入重组后的片段甲，所有的模板应该为菌株B2的基因组进行PCR，如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因，如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。

因为片段甲被替换，因此在重组片段甲（M1+启动子+N基因+终止子+M2）中，没有引物P4的结合位置，因此，使用引物P3和P4进行PCR时无法获得PCR产物。

（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是（答出2点即可）。

参考答案：无环境污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等

解析：秸秆焚烧会引起环境污染，并且有很大的火灾隐患，与此同时，焚烧对于秸秆有机物的能量是一种浪费。